荧光标记Y-STR位点复合扩增试剂盒的开发

一、项目依据及意义



  男女的性别差异由Y染色体决定。正常男性拥有Y染色体,而女性则没有。Y染色体特异区DNA(Y-DNA)在减数分裂中不发生重组,以单倍体形式呈父系遗传,除累积的突变外,由父亲无变化的将其传递给儿子。Y染色体的这些特征,使其在法医学中具有独特、潜在的巨大作用。
  短串联重复序列(STR, 下同)广泛存在于人类基因组DNA中,由长度2~7bp的核心序列串联重复而成,由于重复数目的差异而显现出长度的多态性,成为法庭科学实践中的重要遗传标记。STR片段长度多在400bp以下,容易扩增成功,具有分布广泛、灵敏度较高等特点,可广泛应用于各种法医生物学检材的检验,以及微量、陈旧、腐败检材中的DNA检测。Y染色体特异的STR(Y chromosome specific STR , Y-STR)基因座的发现,为法医学及群体遗传学研究提供了一种新的工具。目前,由常染色体STR位点和Amelonenin基因组成的商品化STR位点复合扩增试剂盒已被广泛应用于我国个体识别、亲权鉴定和DNA数据库的建立,Y-STR位点复合扩增试剂盒在国外也相继得到开发研制,但由于在不同人群间Y-STR基因座等位基因分布存在差异,并且进口的复合扩增检测试剂和仪器昂贵,因此有必要在国内研究和开发适合中国人群的Y-STR位点复合扩增试剂盒。



二、Y-STR位点复合扩增试剂盒的应用前景
1. Y-STR在法医鉴定中的应用
1) 个人识别
Y-STR在法医物证男性个人识别中具有重要用途。绝大多数暴力犯罪案件,用Y-STR对罪犯遗留在犯罪现场的样品进行分型常常获得有关的信息。Y-STR可对混有女性检材的男性检材进行精确检验,而不受女性DNA的影响。目前,强奸案,尤其是轮奸案中混合斑个人识别还是个难题。1个男性个体在1个Y-STR基因座只应有1个等位基因,1个基因座出现2个或2个以上等位基因即可以推断为混合样品,分型比常染色体STR简单,比较容易分析男性混合组成,在检验男性混合样品中具有明显的优点,对于轮奸案件检验很有意义。有些强奸案中的混合斑中检不出精子,利用Y-STR检验技术则可对混合斑精液中的上皮细胞及白细胞等进行分型。利用Y-STR基因座在无法获得在逃嫌疑人检材的情况下,只要有其父亲、兄弟、儿子或亲侄儿等的样本,即可实现与现场检材的对比。
此外,由于Y-STR基因座的男性特异性,在混合样品的检验中,特别是无法用二步消化法分离的混合检材如混合血液,进行Y-STR基因座检验,可以很轻易地排除女性DNA的干扰,得到较为准确的DNA分型。在实际检案中用二步消化法分离精子与女性上皮细胞时,有时会遇到女性细胞去除不净、男性DNA中混有女性DNA,或由于男性精子含量少,在二步消化法分离时丢失男性DNA造成无法得到男性DNA分型的情况,此时应用Y-STR基因座就可以得到理想的结果。基因座具有男性特异性,对于混合斑的检验可以不进行男女细胞的分离,直接提取DNA进行检验,既可防止女性DNA的干扰,也可避免在提取过程中男性DNA的丢失,大大地提高检验的成功率。Honda等[1]用DYS19、DYS390、DYS393、YACⅡ分析男女性DNA之比为1:2000的混合样品都能得到男性Y-STR分型。
2) 亲子鉴定
Y-STR多态性呈父系遗传,他们在父权鉴定,特别是在当事人不全的案件中具有相当大的能力。Y-STR在亲生子鉴定中的平均排除率和在犯罪认定中的个人识别率是相同的。因此,Y-STR检验已被一些实验室列入亲生子鉴定检验项目。虽然Y-STR的应用只限于所检验的孩子是男性这一类案件,但Y-STR检验在被控父亲已不在的父权鉴定中将是唯一的适合方法。当被控父亲已经去逝,他的任何男性血亲都可代替他作检验,以提供关于他的Y-染色体分子结构的全部信息。已经有一些用于父亲缺乏案例的鉴定报告[2、3]。当然在这类案件的鉴定中,要想取得准确的结果,必需进行多个Y-STR位点的检验。
2. Y-STR在人类群体遗传研究中的价值
Y-STR基因座定位于Y染色体的非重组区,在减数分裂时不发生重组,因此父亲的Y-STR遗传特征将会完全不变地遗传给儿子(除突变外),一般情况下Y-STR基因座有着较明显的人群、地域分布特征,不同人群、不同地区人群中不同的等位基因出现的频率存在显著差异[4、5、6]。研究Y-STR基因座可以研究人类父系进化史,对不同人群中Y-STR基因座的等位基因分布频率进行详尽的调查,不仅可以为法医学鉴定提供必要的群体遗传数据,而且在推断嫌疑人的地域、种族特征方面也有着潜在的价值。



三、荧光标记Y-STR位点复合扩增试剂盒的检测特点
  Y染色体的STR多态性不如很多常染色体或X染色体的STR,大部分Y-STR位点呈中等程度的多态性,单个Y染色体的STR基因多样性较低,因而实际检案中通常需同时检测多个位点的单倍型组以提高个体识别率,复合扩增多个Y-STR位点可以大大提高基因多样性值,在法医学上起到提高个体识别率的作用。几个基因座的分型同步进行,避免了单位点扩增时,每个位点必须分别加引物,分别扩增、分别电泳的弊端,在24小时内就可完成,具有快速、简单、节省费用等优点,同时还节省了检材,该点对刑侦破案十分重要。荧光标记Y-STR位点复合扩增试剂盒采用了荧光标记技术,允许STR位点之间片段重叠,与传统的银染系统作复合扩增比较,避免了选取的复合扩增位点彼此之间必须无重叠、一般只能选用3-4个位点作复合扩增的局限性。同时,荧光标记复合扩增的方法在每个泳道中加入了分子内标准,内标准与待测DNA片段在同一泳道,电泳经过的凝胶路径相同,分辨力达±1bp,克服了银染显带所遇到的泳带漂移及人为因素等造成不同泳道内泳动率不同的假象,判型十分准确。
  标准化是法庭科学必不可少的步骤,我国已开始了DNA标准化方面的研究。Y-STR位点复合扩增试剂盒引入了荧光标记复合扩增技术后,从扩增、检测、分型到数据贮存都实现了自动化,有助于实现DNA检验标准化及DNA数据库的建立。



四、荧光标记Y-STR位点复合扩增试剂盒开发内容
1. 根椐已公开发表的文献, 设计Y染色体的8个STR基因座引物。其PCR产物大小各异。这些复合基因座引物产生的个体排除率应约为
2. 上述基因座引物用二种不同荧光素进行标记, 以便区分不同引物产生的大小相同或极为相近的PCR产物片段;
3. 分子内标准的备制: 设计并开发生产19个具不同分子量的DNA标记物(分子量100 bp ~ 500 bp), 并用另一种荧光素进行标记. 作为分子量大小的参照物,比较不同个体基因座产物的多态性;
4. Y染色体的8个STR基因座多态性标准产物混合物备制.



五、市场需求分析
  由于Y-STR多态性呈父系遗传, Y-STR在法医物证男性个人识别和亲子鉴定中具有重要用途。因此可广泛用于司法案件中涉及男性犯罪的侦破、男性亲子鉴定、人类父系进化史研究和不同人群中或不同种族Y-STR基因座的等位基因分布频率等方面的详尽调查。目前国内尚没有究竞有多少性犯罪案的公开统计数椐以及男性亲子鉴定的数据。 但由于我国人口众多、地域宽广、多民族居住,可以予计,这种市场需求仍将是十分可观的。由于受到各种条件限制,目前开展这方面工作的多限于各省或大城市的公安系统和相关大学的司法专业。 应当说将来地、市级司法系统是完全可以开展的, 市场需求将进一步扩大。 国内的市场目前完全是被国外的这类产品所垄断,还没有国内自已生产的可替代的产品。国外的产品价格目前约为15,000.00人民币/盒。我们的产品将以质量好, 又具有较好价格优势打入国内和国际市场,展开竟争,争取在市场上占有一席之地。我们希望在头2 ~3年内该试剂盒年销售额达到约二百万~三百万人民币,利润达到一百万~一百伍拾万人民币左右。



六、工作计划安排
争取在6~8个月内完成上述的开发内容,确定荧光Y-STR复合扩增试验的最佳反应条件及以在实际司法案例应用的评估,并推向市场。



七、预计完成项目需要资金:80 ~ 100万元人民币
八、项目技术负责人
王尚武 医学硕士, 博士后(美国)
执行董事兼总经理,广州市凯诺生物科技有限公司
联系电话和传真: (020)-38491559; 手机: 13925123656