人源化单克隆抗体的研究与开发 ------- 治疗高表达原癌基因neu/erb B2的恶性乳腺癌和其它恶性肿瘤

一、项目依据和意义
  现有的研究表明原癌基因neu/erbB2是多种恶性肿瘤的一个重要标记基因,在美国,研究发现约25%~30%的乳腺癌患者和其它肿瘤部份患者,如卵巢癌、肺癌和胃癌,该基因neu/erbB2都处于高表达状态。根据我国香港、台湾地区的研究报导,大约有与美国相同百分数的乳腺癌患者原癌基因neu/erbB2都处于高表达状态。在基因水平上,原癌基因neu/erbB2的表达具有调控其他相关基因的作用,如促进与肿瘤细胞转移有关因子尿激酶的大量产生,是这些肿瘤恶化和远处转移的重要原因之一。基于上述理由,将原癌基因neu/erbB2单克隆抗体用来对上述肿瘤进行治断和治疗及群体的肿瘤普查都有显著的现实意义。近年来研究证实该抗体对高表达这种原癌基因的恶性肿瘤具有很强的抑制作用,肿瘤明显缩小,有较好的治疗作用。原癌基因neu/erbB2是存在于肿瘤细胞表面上的一种生长因子。在正常状态下,细胞几乎是不表达这种基因的。但肿瘤细胞,尤其是恶性肿瘤细胞,表达大量的原癌基因neu/erbB2蛋白,分布在细胞表面,起着接受、扩大信号的作用。调控着其他相关基因的表达,因而促使肿瘤细胞过度增殖和转移。正因为如此,具高度特异性的抗原癌基因neu/erbB2的单克隆抗体能和恶性肿瘤细胞上的原癌基因neu/erbB2蛋白分子紧密地结合在一起,阻断信号接受和传递,因而抑制肿瘤的增生和扩散,达到治疗目的。然而,鼠源单克隆抗体对人体而言是一种异种蛋白质,使用后会使人体产生新的抗鼠源抗体的抗体,从而中和鼠源抗体的作用。因此鼠源单克隆抗体难以在人体作为治疗药品长期使用。
  近年来随着免疫分子生物学研究的进展,通过生物基因技术成功地生产出人源化抗原癌基因neu/erbB2单克隆抗体,并且应用于临床上恶性肿瘤的治疗,获得了满意的效果。尤其是结合其它治疗手段一起使用时,如抗癌化学药或放射治疗,能大大增加癌细胞对这些药物和放射线的敏感性,加速癌细胞的杀灭。同时也减少了抗癌药物使用量和放射线剂量,从而减轻对人体的损伤。此外,这种人源化单克隆抗体还可作为某些治疗药的媒介物或制造新型药物的平台,如含有化学趋药因子,细胞毒素(已有这方面的研究报告),既能增加药物治疗肿瘤的靶向性,又能更直接、更有效的杀灭肿瘤细胞。
  该人源化抗原癌基因neu/erbB2单克隆抗体已于1998年获美国食品药物管理局批准进行临床应用. 目前这种药物在美国市场价格昂贵。据了解每440毫克的批发价为2200美元。据美国癌协会的报告, 全美现在有一百六十万乳腺癌患者, 每年新发十八万名新患者. 据估计, 如高表达的原癌基因neu/erbb2的患者为全部乳腺癌患者25%,则将有400,000名高表达的原癌基因neu/erbb2的患者适应于这种治疗. 如平均每名患者者花费20,000美元, 美国的理论市场值将有80.0亿美元.而且, 还不包括其他癌症的部份患者. 美国FDA己批准此药在早期乳胞癌,非小细胞性肺癌和前列腺癌的II期临床验证. 这将显示此药有更好的市场前景.在我国尚不知有乳腺癌病例数的统计报告. 但由于我国人口众多, 估计这种癌症患者人数不少于美国的报导. 而且有报导表明由于环境的变化和生活方式的改变或某些未知原因, 近年我国患乳腺癌病例有明显增多趋势. 这种情形表明存在对此种生物基因药需求的巨大市场.我国现在还没有应用这种人源化单克隆抗体治疗肿瘤的报告。因此,开发这种生物药将有广阔的市场前景,并将产生良好的社会效益和经济效益。
  目前美国市场上的产品是应用真核细胞表达系统生产的,这可能是价格昂贵的重要原因之一。在美国,每个疗程患者需花费十几万人民币。我们拟采用原核细胞表达系统进行生产,这将大大降低生产成本,使价格降至每疗程患者仅花费约二万元人民币,因而更具有竞争力。



二、研究开发内容
该项目的具体研究内容应包括:
1、 构建人源化抗原癌基因neu/erb B2的单克隆抗体基因的可变区片段;
2、 构建含上述人源化单克隆抗体可变区片段,在原核细胞内具高表达能力的表达载体;
3、 确定在原核细胞表达的最佳条件;
4、 建立从原核细胞表达抗体蛋白的分离,纯化条件;
5、 进行纯化抗体蛋白的特异性生物活性检测;
6、 应用抗体蛋白,对高表达原癌基因neu/erb B2的恶性乳腺癌细胞的生长抑制效果进行观察;
7、 建立实验肿瘤动物模型,观察该抗体在活体对高表达原癌基因neu/erbB2恶性乳癌细胞的治疗作用;
8、 进行毒理,畸变实验,观察该抗体蛋白可能的副作用和致畸作用;
9、 在上述工作基础上,进行中试扩大实验,为该研究成果产业化打下基础;
拟采用的研究方法和技术线路包括:
1、构建抗癌基因neu/erbB2的单克抗体基因可变区片段。利用IgG抗体基因克隆以及鼠源抗原癌基neu/erbB2的单克隆抗体基因硷基序列,构建人源化抗原癌基因neu/erbB2的单克隆抗体基因可变区片段,对该片段进行硷基序列测定,以确定其正确性。
2、构建表达载体和宿主细胞:
应用基因突变技术,构建含有分泌信号肽和强启动子,如PhoA,oraBAD和Lambda的表达载体和选用经工程化改造的宿主菌株;
3、原核细胞表达系统表达单克隆抗体:
将已构建的质粒转化到经工程化改造的原核细胞内,进行培养,诱导抗体蛋白表达,筛选高表达菌株作为种子菌株;
4、抗体的分离、纯化的技术路线。大部份工作在4℃进行;
5、活性测定:
采用westernBlot法进行检测,收集恶性乳腺癌标本和对照样本,提取TotalRNA和癌细胞蛋白。首先用NorthernBlot法确定高表达原癌基因neu/erbB2的癌细胞标本,然后用HorseRedish法标记人源化抗体进行抗原-抗体结合反应,确定抗体产物的特异性;
6、体外癌细胞生长控制作用观察:
分离高表达原癌基因neu/erbB2的恶性乳腺癌细胞进行原代培养,在培养液中加入不同量的单克隆抗体,并与对照组进行比较,确定单克隆抗体对这种恶性乳癌细胞体外生长控制的作用。
7、动物模型的建立和活体抑癌作用观察:
将分离和培养的高表达原癌基因neu/erbB2的恶性乳腺癌细胞约一百万个分别注入若干组老鼠皮下,7天后测定肿瘤体积大小,然后给予不同剂量抗体进行静脉注射,观察肿瘤体积的变化,并与对照组比较,进行统计分析,以确定活体的抑制作用以及剂量与抑癌关系。
8、毒理、畸变、半衰期研究:
拟请有关高等院校药理教研究进行。
该项目总体计划在二~三 年内完成:
第一年:(1)完成单克隆基因可度区片段的构建和含上述片段的原核细胞表达载体的构建;
        (2)完成单克隆抗体在原核细胞内的表达,生物活性检测;
        (3)完成构建片段DNA序列测定以及表达蛋白质N-未端与C-未端氨基酸序列测定;
第二年:(1)建立表达抗体蛋白质的分离,纯化和成品制剂的最佳条件;
        (2)完成体外、体内表达抗体蛋白质对肿瘤细胞生长抑制作的观察;
第三年: 完成抗体蛋白药代、药效、毒理实验;



拟解决的技术关键:
1、 单克隆抗体基因可变区的构建: 鼠源抗原癌基因neu/erbB2的单克隆抗体基因已经克隆,并测序。由于鼠源抗体对人体的免疫作用, 故构建有高度特异性的抗原癌基因neu/erb B2单克隆抗体基因可变区是本项目首先要解决的技术关键点。
2、 基因产物的分离、纯化:基因工程生产的抗体蛋白的分离、纯化精制是药学研究的关键问题,要求无菌、无热原、无病毒,需要一个十分洁净的工作环境和特殊的分离浓缩技术。
3. 生物活性:除了基因本身的结构原因之外,表达蛋白质的宿主细胞对于蛋白质的生物活性亦有非常重要的影响;真核细胞表达系统最适于真核基因的表达,但成本高、产量低。原核细胞表达系统则对于结构复杂的大分子表达受到较大限制,但有成本低产量高的特点。经工程化改造的原核细胞可用于复杂大分子表达,不会对生物活性造成很大影响。



主要创新点:
1.该项目的关键技术,是以人IgG抗体克隆和鼠源抗原癌基因neu/erbB2单克隆抗体基因为基础,采用基因突变技术的途径而进行的。这项技术与传统的单克隆抗体制备法相比较,大大的节省了时间和财力,可较快地追踪国际先进水平和实现产品产业化, 同时也将为其它同类产品的开发建立良好的技术平台. 虽然在操作上有一定困难, 该技术是成熟可行的.
2.如前所述, 国外的产品是经真核细胞表达系统来生产的. 故生产成本高,导致价格昂贵. 我们将用低成本, 高产出的原核细胞表达系统生产. 因而有较强的市场竞争力.
3.为了增加对肿瘤的渗透性, 该单抗主要为scFv, 其分子量约为30~35kD. 国外产品的分子量为180kD.在美国,每个疗程患者需花费十几万人民币。我们拟采用原核细胞表达系统进行生产,这将大大降低生产成本,使价格降至每疗程患者仅花费约二万元人民币,因而更具有竞争力。



三. 市埸前景分析
  可以肯定,如该项目研究成果产业化成功,就整体而言,该项技术将处于国内领先地位,并将带来丰厚的经济,社会效益。如前所述,在我国(包括台湾、香港地区),大约有40%的女性乳腺癌患者显示有原癌基因neu/erbB2的过高表达,这还不包括用于临床诊断和女性乳腺癌群体普查方面的应用和需求。根据生产该生物药品厂家报告,该药自1998年9月美国FDA批准上市以来,1998年9月到2002年底的销售额共约10.68亿美元。销售额逐年增加。相当于平均每季度销售额为六仟二百万美元. 2000年该产品销售额为二亿柒仟伍百万美元, 1999年为一亿捌仟伍百万美元. 2000年该产品销售额比1999年增加46.4%, 2001年又比2000年销售又增加26% 在2002年销售共计3.85亿美元,比2001年(3.46亿美元)增加了11%。可见这种生物药在美国和其他西方国家深受患者欢迎,有广阔的市场潜力。
  在我国由于人口众多,患乳腺癌患者估计100百万以上,其中可采用这种生物药治疗的患者不少于全部患者的40%,如果大约25%的这种病人接受治疗和每个人平均花费大约人民币20,000元,那么销售额达20,000×(1,000,000×40%×25%)=20亿人民币。最近有报道该生物药对前列腺癌有相当好的疗效。如果加上其它上述部份癌患者的治疗和临床治断以及群体普查的需求,则市场潜力巨大是无疑的。
四. 已具备的条件
经过多年努力和研究,已完成如下的工作:
1、已完成抗癌基因neu/erb B2的单克隆抗体的基因可变区片段构建;
2、成功地构建在原核细胞内具有高表达单克隆抗体的表达载体。
3、巳完成构建含有抗原癌基因neu/erb B2的单克隆抗体基因可变区片段的表达质粒, 并在原核细胞内获高效表达.
     4、成功融合免疫调节刺激因子人源白细胞介素-2基因与抗体基因DNA片段的拼接、进一步连接到表达载体。 在原核细胞获较强表达。



下一步的主要工作:
1.建立蛋白分离实验室硬件条件,确定抗体基因蛋白质和融合基因蛋白质的分离纯化方法,研究上述蛋白质的功能、生物活性以及为后续的体外实验和动物实验作准备。
2.建立细胞培养所需的必要条件和建立高表达原癌基因neu/erbB2的肿瘤细胞株,为体外肿瘤细胞生长抑制实验和Westen Blotting实验打下基础。
3.建立动物模型,为分离纯化的蛋白质在体内对肿瘤细胞生长抑制进行观察。
  此外,还包括纯化蛋白质的理化特性测定, 如蛋白质N-未端和C-未端氨基酸构成,等电点测定,纯度测定,溶解度测定和活性保存温度等。本项目研究组有较强的科技研究队伍,包括从国外归来的博士、硕士和研究人员,长期从事分子生物学和细胞生物学的研究。同时与中山医科大学的有关研究科室有密切协作关系,为进一步研究和产品的开发打下基础。
五、项目负责人
王尚武 医学硕士, 博士, 博士后, 在美国著名的Baylor医学院和M.D.Anderson癌研究中心作为研究员, 从事肿瘤分子和细胞生物学研究多年. 出国前广州中山医科大学第一附属医院从事临床工作.
联系电话和传真: (020)-38491559; 手机: 13925123656
六.、预计项目所需经费, 预算及主要仪器, 设备
预计完成临床前资料需要资金:300 ~ 500万元人民币